你应该总是首先确定阳性细胞的数量在你最不频繁的细胞群,你要分析(或类),然后再计算从那里估计试验所需的原始材料。如果您感兴趣的稀少人口的期望频率如1 1000年(0.1%)和你想要100年积极事件门然后你需要分析至少100000细胞。

但注意,你可能失去了一些细胞染色的协议和部分样本体积无法分析(~ 100µL仪表/管死体积)所以很安全开始至少一半一百万细胞/样品,最后悬浮量不少于200µL流式细胞仪管。和你需要的相同的一百万细胞/管也给你一个污点/ FMO控制!此外,如果您正在执行单元排序考虑到排序效率有时会低至50%,一些积极的细胞“与他人一起旅行”是故意把废料箱(取决于类型设置)保证收集到的人口的纯度。所以你可能需要两倍的原始材料,如果你有困难样本与大量的碎片和总量。

• 流式细胞术需要同质单一细胞悬浊液。检查样品质量(可行性)在光学显微镜下之前运行实验。样品的可见总量不应把乐器。
  • 细胞团和其他聚合将堵塞仪器和打断你的实验
  • 碎片和死细胞可能影响你流的速度和精度分析和纯度/恢复你的细胞类型
• 总是应变你的细胞;我们建议使用35µm过滤帽流式细胞仪管
• 高度聚集的细胞类型甚至可能需要限制在长期运行实例。
• 夏皮罗的流式细胞术第一定律:“51µm粒子堵塞50µm孔!”
• 无血清条件下,二价阳离子通过EDTA螯合治疗(1 - 5毫米)和/或DNAse(200µg /毫升)可以减少细胞聚合。
• 典型的细胞浓度是1 - 10每毫升百万细胞体积和最小推荐样品200 - 300µL

典型的流式细胞仪缓冲区包含钙/镁免费PBS以小蛋白(有时是其他添加剂),提高细胞活力,减少非特定的染色,并避免坚持塑料表面。悬浮细胞培养基通常是不推荐的由于相对较高的自体荧光,pH缓冲在典型流条件差和存在附着力促进组件。

• 从PBS含有0.5% BSA(或1 - 2%的边后卫)和优化

• 细胞分析仪应该使用刚性(5毫升)聚苯乙烯管与仪器确保良好密封o形环;AriaII细胞分选仪可以使用聚苯乙烯或聚丙烯管(5毫升或15毫升)
• 下面的管子是已知的与我们的工具但也可以使用其他品牌和类型:
  • 5毫升流式细胞仪管与35µm过滤帽(康宁,猫# 352235)
  • 5毫升流式细胞仪管弹簧帽(康宁,猫# 352054)
  • 15毫升锥形管(康宁,猫# 352096)

面板设计的目标是优化分析决议通过创建光明积极的人口同时最小化蔓延的底片(见也补偿控制和FMO控制)。

1. 知道你的仪器的光学配置和荧光团光谱
2. 跨多个激光和遥远的发射范围划分荧光团
3. 把明亮的荧光团罕见的细胞标记/低表达,微弱的荧光团丰富细胞/高度表达的标记
4. 把高溢出荧光团互斥的标记
5. 使用单个转储通道排除不受欢迎的人群

1. 单一污染控制必须的或比实际样品
   • 但必须保持在线性范围内的信号
2. 背景(=自体荧光)的阴性和阳性必须匹配
   • 两个种群必须相似类型的细胞或珠子
3. 控制和样品的荧光团必须是相同的
   • 串联染料必须来自同一瓶
   • 治疗控制样品(修复/烫,染色过程中,存储等。)
4. 收集到足够的正面和负面的事件数量
   • 热杀死细胞,诱导所需的表型,用捕捉珠子代替染色细胞等明确的积极的人口罕见的事件。

常见的排序规则:

• 喷嘴的大小应该至少5倍细胞直径
• 总事件率(包括碎片和死细胞)应不超过1/4的频率下降

我们的默认设置为所有细胞类型使用AriaII: 100µm喷嘴,20 psi压力和30千赫频率下降。通常你可以预计排序效率≥80%,纯度≥90%运行时每小时≤500万总细胞纯度使用掩码设置。

• 吸样本,碎片和更快的流量通常减少排序效率和纯度的人群中恢复过来。
• 光显微镜下观察到的细胞复苏(手动计数)可能会远远低于仪器报道效率如果如下降延迟是校准,排序过程中细胞死亡(pH值和压力变化,管壁上干燥)或细胞消失在下游加工步骤(管和缓冲更改)
• 复苏的体积是3毫升(PBS)每100万个细胞
• 特殊要求我们可以加快排序过程使用70µm喷嘴(主要为淋巴细胞)或提高侧流质量使用130µm喷嘴(异常大细胞)。

• BD生物科学,https://www.bdbiosciences.com/en-us/applications/beplay苹果手机能用吗research-applications/multicolor-flow-cytometry/product-selection-tools/spectrum-viewer
• Bio-Rad -https://www.bio-rad-antibodies.com/spectraviewer.html
• ThermoFisher科学- - - - - -https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cell-analysis/labeling-chemistry/fluorescence-spectraviewer.html
• 荧光蛋白数据库,https://www.fpbase.org/spectra/

请注意,并不是所有的荧光团都包含在每一个在线工具;核心设备并不支持任何特定的产品或品牌。

我们所有的仪器在EasyPanel和FluoroFinder面板builder工具。

• 人工智能生成完整的面板与选项根据需要手动优化EasyPanel
• 手动匹配标记从一个给定的列表——荧光团FluoroFinder

有各种各样的网上建立实验室协议和培训视频。好好利用!

详细的实验室用于流式细胞术的协议

• ThermoFisher科学- - - - - -https://www.thermofisher.com/us/en/home/references/protocols/cell-and-tissue-analysis/flow-cytometry-protocol.html
• Bio-Rad -https://www.bio-rad-antibodies.com/flow-cytometry-protocols-procedures.html

流式细胞仪,在线教程和其他参考资料

• 流式细胞术基本指南(Bio-Rad)https://www.bio-rad-antibodies.com/introduction-to-flow-cytometry.html
• 介绍流式细胞术(BD生物科学)https://www.bdbiosciences.com/en-us/support/training/e-learning-courses
• 分子探针的荧光https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cell-analysis/cell-analysis-learning-center/molecular-probes-school-of-fluorescence.html
• mac学院(Miltenyi研究)https://www.miltenyibiotec.com/US-en/resources/macs-academy/on-demand-webinars-and-tutorials.html
• 色素细胞收集的在线资源https://www.chromocyte.com/educate
• CytoU在线研讨会,https://learning.isac-net.org/
• FlowJo软件教程,https://www.flowjo.com/learn/flowjo-university/flowjo
• 普渡血细胞计数-讨论列表http://www.cyto.purdue.edu/hmarchiv/index.htm
• 专家血细胞计数博客和youtube频道https://expert.cheekyscientist.com/blog/,https://www.youtube.com/channel/UCdVW5fDLxx75nblr9NVtCTA

我们的服务中心有专门的数据分析站在我们两的位置给你免费获取FlowJo,卡鲁扎和女主角的软件。这些和许多其他选项也可以下载自己电脑,经常用30天的免费试用。

一些主要的商业平台(30天的免费试用):

• FlowJo -https://www.flowjo.com/solutions/flowjo
• Kaluza -https://www.beckman.com/flow-cytometry/software/kaluza
• FCS表达-https://denovosoftware.com/
• Cytobank -https://www.cytobank.org/platform.html
• OMIQ -https://www.omiq.ai/
• WinList -https://www.vsh.com/products/winlist/index.asp

一些鲜为人知的选择(廉价或免费):

• 黄鼠狼-https://frankbattye.com.au/Weasel/index.html
• Floreada -https://floreada.io/analysis

• FlowTex -https://www.flowtex.org/
• 国际社会促进血细胞计数(直接督导下的https://isac-net.org/